复旦大学丁建东教授课题组《ACS AMI》: 材料表面活性配体的纳米间距可以显著调控血管内皮细胞与血管平滑肌细胞的相对迁移速率

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材料策略是组织再生修复的主要策略之一。在材料诱导组织再生过程中，细胞与材料相互作用，尤其是多种细胞在材料表面的迁移是组织再生的重要前提。不同类型细胞在材料表面的差异迁移，是组织再生材料设计的重点和难点。现有研究表明：材料表面的拓扑结构、电荷情况、微米或纳米图案化改性等是调控细胞迁移的主要手段。然而，对于精确调控材料表面细胞的差异迁移，迄今鲜有报道。 

最近，复旦大学丁建东教授课题组利用整合素的配体精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）多肽对材料进行纳米尺度的表面修饰。针对血管再生的主要细胞类型内皮细胞和平滑肌细胞，发现仅通过调节RGD纳米间距，就可实现对这两种细胞相对迁移速度的双向调控：内皮细胞、平滑肌细胞之间的相对迁移速度得以扩大、减小甚至实现逆转。这一研究深入探讨了RGD纳米间距在调控不同细胞类型之间差异迁移中的重要作用，提供了一种新的、 可实现不同类型细胞差异响应和差异迁移的组织再生材料表面纳米修饰方法。

首先，他们通过嵌段共聚物胶束自组装纳米刻蚀技术，在基底表面获得不同纳米间距的金点纳米阵列。在材料表面接枝聚乙二醇（PEG）进行钝化处理后，将RGD多肽接枝于金点纳米阵列上（图1），最终得到了一系列不同间距的RGD纳米图案化表面。

 

图1 RGD纳米图案化阵列材料的制备与表征

A. 利用BCMN技术制备基底上的纳米金点阵列。B. 原子力显微镜（AFM）图片（上方）与场发射扫描电子显微镜（FESEM）图片：显示了一系列纳米间距图案化修饰（下方）。

为了观察细胞在材料表面的黏附情况，他们将脐静脉内皮细胞（HUVEC）、人主动脉平滑肌细胞（HASMC）接种于RGD纳米图案化修饰材料表面。结果发现，随着RGD纳米间距的增大， HUVEC和SMC的细胞黏附面积、黏附密度均呈下降趋势，但下降的程度取决于细胞类型，即SMC下降速度比HUVEC快（图2）。

图2平滑肌细胞（SMC）与内皮细胞（EC）在不同间距纳米图案上的细胞黏附

A. 两种细胞在RGD纳米图案上的黏附荧光图（蓝色：细胞核；红色：F-actin）。B. 对两种细胞的黏附面积、黏附数量的统计。（以各自细胞类型的non-nano组别进行数据的归一化处理）。

为进一步观察RGD图案化表面对细胞迁移的调控作用，他们设计了单细胞迁移实验和细胞集体迁移实验（划痕实验）。结果表明：两种细胞的迁移速率都表现出随纳米间距增大的非单调变化趋势（即先上升后下降），但它们的迁移速度峰值出现在不同的纳米间距组别，SMC为74 nm, ECs为95 nm（图3、图4）。因此，可以推断，这两种细胞对RGD纳米间距的敏感性不同。尽管HUVEC在非纳米表面上的迁移速度与SMC大致相当，但通过调节RGD的纳米间距，HUVEC的迁移速度可以显著高于或低于SMC。例如，在57 nm、74 nm间距的表面，SMC的迁移速度明显高于HUVEC，而在95 nm间距表面，SMC的迁移速度明显低于HUVEC。在74 nm、95 nm两个间距之间，两种细胞的迁移速度大小关系（相对迁移速度）甚至发生了逆转。

图3 平滑肌细胞（SMC）与内皮细胞（EC）在不同间距纳米图案化材料表面的单细胞迁移实验

A. 使用活细胞工作站对单细胞的迁移位置进行实时拍摄。B. 代表性细胞的迁移轨迹图。C. 对细胞的扩散系数、轮廓迁移以速度的统计，用以反映单细胞迁移能力。

图4平滑肌细胞（SMC）与内皮细胞（EC）在不同间距纳米图案化材料表面的集体细胞迁移（划痕实验）

A. 两种细胞在RGD纳米图案上的集体迁移荧光图（蓝色：细胞核，白色虚线代表初始划痕位置）。B. 对两种细胞的集体迁移速度的统计。C. 两种细胞的相对迁移速度统计（集体迁移情况）。D. 两种细胞的集体迁移速度在74 nm与95 nm间发生了逆转。

在迁移调控研究的基础上，他们进一步发现内皮细胞和平滑肌细胞在纳米图案化表面存在差异响应，具体表现在：随着RGD纳米间距的增大，F-肌动蛋白（F-actin）的形貌变化呈现有不同的规律（图5）。在小间距纳米图案上（33 nm），平滑肌细胞拥有相对较粗、较长并且平行排列的肌动蛋白束，而内皮细胞的F-actin则表现出较细、较短且相对随机的组装结构。

图5平滑肌细胞（SMC）与内皮细胞（EC）在不同间距纳米图案上的荧光显微图片

经分析认为，由细胞前端的新生黏附（Nascent adhesion）出现而产生的拉力，细胞后缘的焦点黏附（Focal adhesion）解离而产生的阻力，以及微丝束（Actin bundles）提供的拉力共同决定了细胞迁移（图6）。平滑肌细胞在纳米间距由小变大的过程中，F-actin提供的力在关键纳米间距70 nm处产生了急剧的下滑，而对于内皮细胞，这一力量的变化并不明显，这可能是平滑肌细胞的迁移速度峰值出现在了相对靠近70 nm的原因所在。

 

图6平滑肌细胞（SMC）与内皮细胞（EC）在不同间距RGD纳米图案上的黏附和迁移相关机制的示意图

A. 细胞的新生黏附、焦点黏附与肌动蛋白束随纳米间距变化的规律。B. 细胞的新生黏附、焦点黏附与肌动蛋白束产生的力共同决定了细胞迁移的变化。

  该研究揭示了材料表面RGD配体的纳米尺度空间分布对细胞行为的调控规律。通过调节图案化材料表面的RGD的纳米间距，可以提高、降低甚至逆转血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的相对迁移速度。这种基于纳米空间的控制方式揭示了与正常表面不同的是，合适的配体纳米图案化修饰可以突出细胞类型之间固有的材料响应差异，从而引起迁移差异。这一发现对今后如何设计组织再生生物材料表面，促使其能够调控多细胞类型间的相对迁移速度具有一定的指导意义。

以上相关成果以标题为“Enlargement, Reduction, and Even Reversal of Relative Migration Speeds of Endothelial and Smooth Muscle Cells on Biomaterials Simply by Adjusting RGD Nanospacing”发表在ACS Applied Materials & Interfaces。

论文的共同第一作者是复旦大学高分子科学系研究生何俊豪，第二军医大学特色医学中心刘琼博士，通讯作者为复旦大学聚合物分子工程国家重点实验室主任丁建东教授。

相关链接

https://doi.org/10.1021/acsami.1c08559

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